Brd2在3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中的作用及机制研究

【摘要】脂肪组织主要由脂肪细胞所组成,过多的热量摄入并以甘油三酯的形式储存在白色脂肪细胞内是肥胖发生的关键。前脂肪细胞的增殖分化是成熟脂肪细胞形成的核心,从前脂肪细胞分化成成熟的脂肪细胞的过程十分复杂,特别是机体内多种细胞因子和激素在脂肪细胞发生过程中可能都有调节作用。BRD2属于BET蛋白家族,在哺乳动物细胞中广泛表达,具有多种生物学功能,最新的研究表明Brd2基因突变能导致小鼠过度肥胖而不引起糖尿病,但是其作用的分子机制并不明确。在本课题中,我们观察了Brd2表达变化对前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程的影响,并且重点研究了Brd2参与的信号通路在影响前脂肪细胞向脂肪细胞分化作用的分子机制,弥补了这一部分研究的空白。在研究中,我们发现Brd2表达的下调,能促使3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的分化,甚至在无任何诱导分化剂的情况下,部分细胞也能分化成脂肪细胞；相反的,当Brd2过表达时,即使诱导分化至第8天,细胞分化也几乎完全被抑制。这就更加表明Brd2在前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中有重要的作用,同时我们认为,上述现象的产生可能是由于Brd2表达的变化影响了一些分化相关基因甚至是关键基因的表达。为了研究Brd2表达的变化对脂肪细胞分化相关基因表达的影响,一方面我们利用RNA干扰技术,下调3T3-L1前脂肪细胞内Brd2的表达水平；另一方面运用将pmBrd2载体将Brd2基因导入3T3-L1前脂肪细胞,使细胞内的Brd2过表达,然后先通过RT-PCR技术检测了PPARy和C/EBPa的时序性表达,结果表明Brd2对脂肪细胞分化的两个关键基因PPARy和C/EBPa都有显著的负调节作用；继而运用Q-PCR技术,我们又检测了其它相关基因的表达,结果显示,422/aP2、Glut4、Leptin和Irs-1的表达都有显著的改变,而Pfkfbl的表达则没有受到明显的影响。已有研究证明PPARy是ERK的下游分子,当ERK通路激活后,PPARy发生磷酸化,转录活性降低从而抑制了分化,而Wang等的研究又证明了Brd2可抑制(?)PPARγ的转录活性,由此我们首先推断Brd2可能通过ERK信号通路影响脂肪细胞的分化；其次,Glut4表达的变化直接关系到细胞的糖摄取量,而在脂肪细胞中,与糖代谢密切相关的Insulin信号通路和AMPK信号通路都可刺激GLUT4的转位,促进细胞对葡萄糖的摄取,其中Insulin信号是通过IGF-1R激活了IRS-1和IRS-2再进一步激活PI3K/Akt信号通路,最后作用于GLUT4;而在AMPK信号通路中,AICAR则可不依赖于Insulin作用而直接激活AMPK,进而刺激GLUT4的转位。在Wang等的研究中,Brd2缺失的小鼠进食量剧增,但其血糖水平并未随摄糖量的急剧增加而升高,反而与野生型小鼠相比有所下降,因此,我们认为Brd2可能通过Insulin和AMPK信号通路来共同调节脂肪细胞的糖代谢。为了证实Brd2是否通过ERK信号通路影响脂肪细胞的分化,我们先利用RNA干扰技术使3T3-L1细胞内的Brd2基因沉默,然后再通过转染pmBrd2使细胞内的Brd2过表达,随后检测Brd2表达的变化对ERK、Raf和JNK的磷酸化水平的影响,结果表明ERK的磷酸化水平有明显的变化,但其上游的Raf则未受到明显的影响,同时JNK信号通路也与此过程无关；然后为了进一步确定ERK信号通路在该过程中的作用,我们观察了ERK激酶MEK1的特异性化学抑制剂U0126对此过程的影响,结果表明U0126可使Brd2过表达的细胞部分恢复分化,同时aP2的表达也得以回调。综合以上结果可证实：ERK信号通路参与了Brd2调节3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化的过程,而JNK信号通路则与之无关。同样,为了证实Brd2可能通过Insulin和AMPK信号通路来共同调节脂肪细胞糖代谢,我们利用RNA干扰手段下调Brd2的表达后发现Akt的磷酸化水平明显升高,而通过P13K的特异性化学抑制剂LY294002可使Akt升高的活性降低,相反的,当Brd2过表达时,Akt的活性则受到了抑制；同时,在研究AMPK信号通路中,我们发现Brd2具有负调节AMPK活性的作用：当Brd2表达下调时,AMPK的磷酸化水平明显升高,而通过AMPK的特异性化学抑制齐(?)CompoundC和Insulin都可降低AMPK的升高的活性,反之,当Brd2过表达时,AMPK的活性则受到了抑制；并且当Brd2基因沉默时,P13K的特异性化学抑制剂LY294002和AMPK的特异性化学抑制(?)CompoundC都能使GLUT4蛋白表达水平显著下降。但是Brd2表达的变化对于GSK-3的活性却并不产生影响。由此,上述结果证实了我们的猜想：Brd2通过Insulin信号通路和AMPK信号通路调节3T3-L1前脂肪细胞GLUT4的表达,进而调节细胞对葡萄糖的摄取,但并不影响细胞的糖原合成。综上所述,在本研究中,我们证实了Brd2在3T3-L1前脂肪细胞中参与了ERK、Akt和AMPK信号通路,调控了某些相关基因的表达,影响了前脂肪细胞向脂肪细胞的分化和糖代谢,但对ERK、Akt和AMPK信号通路中涉及的有关转录、蛋白质合成及脂代谢还需进一步的研究,最终更为详细地证实Brd2在脂肪细胞分化中的作用机制。
【作者】臧坤；
【导师】于敏；
【作者基本信息】复旦大学，分子医学，2012，博士
【关键词】Brd2；脂肪细胞；分化；ERKJNK；糖代谢；胰岛素；AMPK；

【参考文献】
[1]潘庆春.NICU新生儿听力筛查的临床意义初探[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[2]王燕玲.初中数学学困生的成因与转化研究[D].聊城大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[3]孙柏峰.吉林省某市空气质量评价及预测[D].吉林大学,环境工程,2013,硕士.
[4]郭贺敏.外置电场低频超声加速经皮给药系统的实验研究[D].河南科技大学,仪器仪表工程（专业学位）,2014,硕士.
[5]徐健,张清川.桩基静载试验在地基基础工程中的经济效益分析[J].重庆建筑.2004(01)
[6]何艳.血栓前体蛋白和抗凝血酶-III在糖尿病微血管病变患者中的检测及临床意义[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[7]令狐博.对外汉语词汇教学各环节教学方法[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[8]刘恩清,宋忠臣,祁恒江,刘振忠,徐英辉,马照东.接管马鞍形大厚度焊缝焊接技术研究及其实施[J].一重技术.1997(02)
[9]袁梓淇.我国上市公司并购绩效的实证研究[D].厦门大学,金融学,2014,硕士.
[10]王丹.基于共享内存用于存储VLR的数据库的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[11]李典贤.灌区水情监控系统的设计与软件实现[D].西南交通大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[12]黄文娟.纳米氧化物异质结构光阳极材料的火焰喷雾热解制备及其电化学性能[D].华东理工大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[13]丁海星.FlexRay/CAN网关在车载系统中的应用研究与实现[D].西安电子科技大学,机械电子工程,2012,硕士.
[14]曲波.基于克隆选择计算的入侵检测方法研究[D].西安电子科技大学,2005.
[15]庞泽坤.论我国消费者公益诉讼制度的构建[D].河北大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[16]周安德.马来西亚城际动车组电气系统设计[D].西南交通大学,电力牵引与传动控制,2012,硕士.
[17]孙崟霞.基于ARM平台的水环境无线监测装置的研究与实现[D].南京邮电大学,仪器仪表工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]朱晓.黑龙江省新型农村社会养老保险发展水平分析[D].东北农业大学,金融学,2013,硕士.
[19]王永杰,吴文传,张伯明.考虑负荷量测和光伏不确定性的主动配电网鲁棒电压控制[J].电力系统自动化,2015,09:138-144.
[20]托合提江·拜合提.单壁碳纳米管（SWCNTs）电子特性研究[D].新疆大学,2014.
[21]吴小明.昆山陆路口岸入境集装箱内甲醛残留现状及其对策研究[D].苏州大学,公共卫生（专业学位）,2012,硕士.
[22]郑明平.水利建设项目甲乙类划分及资金筹措方式研究[D].河海大学,水利水电工程,2004,硕士.
[23]彭云.矿井通风系统降阻优化研究[D].湖南科技大学,采矿工程,2013,硕士.
[24]李佳.民俗习惯的司法价值初探[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[25]李晓蔚.城市道路通行效率及其影响因素的量化分析[D].北京交通大学,2012.
[26]王灿.基于极值统计的洪水频率分析模型及其应用研究[D].湖南师范大学,应用统计（专业学位）,2013,硕士.
[27]谭芳.仪式观视角下的茶文化传播[D].华中师范大学,传播学,2014,硕士.
[28]陈浩.761例动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者临床特点分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[29]丁一鸣.物联网业务表示与选择机制的研究与实现[D].南京邮电大学,信息网络,2013,硕士.
[30]范一峰.基于Adaboost算法的人脸检测研究[D].浙江工业大学,2009.
[31]张敏丽.意识形态对英汉文学翻译的影响[D].广东外语外贸大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[32]朱云龙,徐家旺,黄小原,葛汝刚.逆向物流流量不确定闭环供应链鲁棒运作策略设计[J].控制与决策,2009,05:711-716.
[33]倪彤光,王士同.适用于不确定类标签数据学习的迁移支持向量机[J].控制与决策,2014,10:1751-1757.
[34]赵立慧.基于CLOUDSIM平台的云任务分配策略研究[D].内蒙古农业大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[35]张利芳.抗菌肽ABPS1真核表达载体的构建及其在肿瘤基因治疗中的初步应用[D].中国农业大学,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[36]姬慧勇,谭业发,蒋国良,董德才.铲斗切削处土壤表面变化算法[J].计算机仿真,2004,01:68-70.
[37]王嫚.反垄断私人诉讼激励机制研究[D].西南政法大学,经济法学,2012,硕士.
[38]黄飞.基于STIRPAT的中国碳排放量影响因素研究[D].重庆工商大学,统计学,2014,硕士.
[39]张广西.基于多特征的粒子滤波行人跟踪算法研究[D].大连理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[40]刘志刚.试论“文革”前十年文化建设的历史经验[D].湖南师范大学,中共党史,2004,硕士.
[41]刘文祥.精神贫乏时代的历史叙事[D].曲阜师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[42]李进林.网络炒作事件中的受众心理分析[D].南京师范大学,基础心理学,2012,硕士.
[43]贺美德,刘军,乐贵平,王梦恕,张顶立.盾构隧道近距离侧穿高层建筑的影响研究[J].岩石力学与工程学报,2010,03:603-608.
[44]张永明.Fractalkine在大鼠肝硬化模型全肝血流阻断致肺损伤机制中的表达及意义[D].滨州医学院,外科学,2011,硕士.
[45]孙伟.APC控制原理及其应用[J].冶金自动化,1987,02:37-41.
[46]徐晓初,章巧芳,彭伟,宫林林,翁金学.气动钉枪内部流场PIV实验测量系统的设计[J].中国制造业信息化,2012,01:64-67.
[47]王珂.果蝇PCNA蛋白的原核表达、初步晶体学研究与结构分析[D].青岛大学,微生物学,2013,硕士.
[48]朱占巍.利用电力系统宽带网建立故障信息系统[D].华北电力大学（北京）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[49]王敏.杏鲍菇真空低温脱水工艺研究及产品开发[D].南京农业大学,食品科学,2012,硕士.
[50]赵作富.黄土地区填方路堤温度场分布规律试验研究[D].长安大学,岩土工程,2013,硕士.